ÿþVor dem puma basket heart black Hintergrund einer früheren Studie [25], in der gezeigt wurde, dass ErbB4 mit Bcl-2 interagiert und dass EGFR / EGFRvIII und ErbB4 eine strukturelle Homologie aufweisen, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII mit den drei proapoptotischen Proteinen, die mit Bcl-2 koexprimieren, einen Komplex bildet Rezeptoren. Wie aus den Ergebnissen der Immunpräzipitation (IP) / Western-Blotting unter Verwendung eines EGFR-Antikörpers für IP (1c) hervorgeht, bildet EGFRvIII in GBM-Xenotransplantaten mit endogenem EGFRvIII (D-270 MG) einen Komplex mit PUMA, jedoch nicht mit Bax und Bmf und D-317 MG) und mit stabil transfiziertem EGFRvIII (U87MGEGFRvIII). In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass PUMA in drei EGFR-exprimierenden GBM-Zelllinien mit EGFR coimmunopräzipitiert (1d).

Die Regressionsanalyse zeigt ferner, dass die Koexpression von EGFR allein, PUMA allein und EGFR / PUMA signifikant mit dem Gliomgrad korreliert (2a). Zwei repräsentative immungefärbte Gliome sind in 2b puma basket heart damen gezeigt, in denen ein GBM (oberes Feld) sowohl für EGFR / EGFRvIII als auch für PUMA eine positive Färbung zeigt und im Gegensatz dazu ein Grad II-Gliom (unteres Feld) für beide Proteine   negativ färbt. Der im EGFR / EGFRvIII-IHC verwendete Antikörper erkennt puma basket heart kinder ein C-terminales Epitop, das sowohl im EGFR- als auch im EGFRvIII-Rezeptor vorhanden ist, und aufeinanderfolgende Tumorschnitte wurden in diesen Studien verwendet. Der hohe Grad der EGFR / EGFRvIII-PUMA-Co-Expression in primären GBM-Proben stimmt mit den Beobachtungen in 1 mit den GBM-Zelllinien überein.

U87MG-Zellen wurden mit Kontroll-siRNA und PUMA-spezifischer siRNA 24 Stunden lang transfiziert und 48 Stunden lang 100 ng / ml Anisomycin, einem wirksamen Apoptose-Induktor, ausgesetzt. Die Zellen wurden dann dem TUNEL-Assay unterzogen, um das Ausmaß der Apoptose zu bestimmen. Rote Fluoreszenz: mit Propidiumiodid gefärbte Kerne. Grüne Fluoreszenz: fragmentierte DNA. Gelbe puma basket heart patent fusionierte Signale: Kernfragmentierte DNA. (B) Western Blot zeigt einen spezifischen und effizienten PUMA-Expressions-Knockdown nach der Transfektion von PUMA-spezifischer siRNA an, jedoch keine Kontrolle von nicht zielgerichteter siRNA. (C) Eine erhöhte EGFRvIII-Expression verleiht GBM-Zellen eine Resistenz gegen Apoptose.

Diese Beobachtungen wurden in stabilen Transfektanten von U87MG-EGFRvIII (oberes Feld) und U87MG-EGFR (mittleres Feld) sowie in T98G-GBM-Zellen gefunden, die hohe Mengen an endogenem EGFR (unteres Feld) exprimieren. Als Negativkontrollen verwendetes Maus-IgG ergab kein Signal, was auf die Spezifität des Assays hinweist. Es ist bemerkenswert, dass die endogenen EGFR-Spiegel durch Staurosporin in T98G-Zellen leicht verringert wurden (rechtes Feld). Dies wird möglicherweise auf die Caspase-vermittelte Spaltung nach Staurosporin-Behandlung zurückgeführt [39]. Sowohl EGFR als auch EGFRvIII existieren im Komplex mit PUMA konstitutiv und die Wechselwirkungen werden unter apoptotischem Stress aufrechterhalten.

Im Gegensatz dazu war PUMA in U87MG-Vektorzellen mit sehr geringer EGFR-Expression ausschließlich in den mitochondrialen Fraktionen unabhängig von apoptotischem Stress vorhanden (5b). Die Wirksamkeit der Zellfraktionierung wird durch das Fehlen des cytoplasmatischen Markers ±-Tubulin in den mitochondrialen Extrakten und das Fehlen des mitochondrialen Markers puma basket heart sale Cox IV in den nichtmitochondrialen Extrakten angezeigt.

PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma dieser Zellen unter unbelasteten und gestressten Bedingungen lokalisiert, was durch die niedrigen mtPUMA-Indizes angezeigt wird. Ähnliche Beobachtungen wurden auch in T98G-GBM-Zellen gefunden, die auf natürliche Weise EGFR exprimieren (5c). Der bescheidene Nachweis von mitochondrialem PUMA in diesen Zellen kann möglicherweise das Ergebnis einer unzureichenden zytoplasmatischen EGFR sein, um mit allen PUMA-Molekülen im Zytoplasma zu interagieren und diese zu sequestrieren. Wichtig ist, dass der siRNA-vermittelte Abbau der EGFR-Expression zu einem signifikanten Anstieg (16-fach) des mitochondrialen PUMA führte (Abb. 5c-links), was weiter darauf hindeutet, dass EGFR die mitochondriale PUMA-Translokalisierung modulieren kann.